Isabel de Portugal nació en Lisboa el 24 de octubre de 1503, falleciendo en Toledo el 1 de mayo de 1539. Fue la única esposa de Carlos I de España, y por tanto emperatriz del Sacro Imperio Romano Germánico y reina de España. Actuó como gobernadora de los reinos españoles durante los viajes por Europa de su marido.

Isabel era la segunda hija del rey Manuel I de Portugal y de su segunda esposa María de Aragón, siendo por tanto infanta de Portugal por nacimiento.

Llevaba el nombre de su abuela materna, Isabel I de Castilla, y su tía Isabel, princesa de Asturias, que había sido la primera esposa de su padre.

En la línea genealógica de su padre, era nieta del infante Fernando, duque de Viseu (segundo hijo del rey Eduardo de Portugal y hermano del rey Alfonso V de Portugal), y de la infanta Beatriz, hija de Juan de Portugal (hermano del rey Eduardo). A través de su madre, era nieta de los Reyes católicos.

Isabel fue la segunda en línea sucesoria hasta el nacimiento de su hermano Luis en 1505. Sin embargo, como hija mayor de Manuel I de Portugal, era deseada como cónyuge. Se casó con su primo hermano Carlos I de España, hijo de Juana de Castilla y Felipe el Hermoso, duque de Borgoña, que como emperador del Sacro Imperio, rey de España, archiduque de los dominios de los Habsburgo, duque de Borgoña y gobernador de los Países Bajos y del imperio español en las Américas e Italia, fue uno de los hombres más poderosos de su tiempo.

En 1521 murió Manuel I y le sucedió su hijo Juan III el Piadoso. Las negociaciones entre los dos reinos de la Península Ibérica dieron como resultado una doble unión hispano-lusa. En 1522 se acordó el matrimonio entre Juan III y Catalina de Austria, hermana menor de Carlos I. Tres años después, en 1525, es su hermana Isabel la que se uniría a Carlos I, el 11 de marzo de 1526, teniendo ella 23 años y él 26. La boda se celebró en los Reales Alcázares de Sevilla, en el actual Salón de Embajadores.

Este acuerdo fue importante desde el punto de vista económico para la monarquía hispánica, ya que Isabel aportó una cuantiosa dote, 900.000 doblas de oro, mientras que Carlos otorgaba a su futura esposa todas las rentas del señorío de la ciudad de Alcaraz de La Mancha, así como en calidad de arras 300.000 doblas, para lo cual hubo de hipotecar las villas jienenses de Úbeda, Baeza y Andújar. A pesar de que el matrimonio se realizó por motivos políticos, se dice que fue una pareja feliz; el Rey le fue fiel (tuvo otros hijos, pero en su soltería y viudez) y tras la muerte de Isabel, Carlos I no volvió a contraer matrimonio. Isabel era considerada una de las mujeres más bellas de su época, y como tal fue retratada por artistas como Tiziano o Leone Leoni.

El matrimonio tuvo cinco hijos, siendo el mayor, el futuro Felipe II de España, el único varón en sobrevivir a la niñez. Isabel de Portugal también sufrió dos abortos y no sobrevivió al segundo, ya que murió dando a luz un prematuro séptimo hijo en uno de los aposentos del toledano palacio de Fuensalida, lugar que hoy alberga la Presidencia del Gobierno de Castilla-La Mancha.

A la muerte de Isabel, Carlos I se retiró al Monasterio de Santa María de la Sisla, encargando a su hijo Felipe la presidencia de la comitiva que trasladó el cadáver de la Emperatriz desde Toledo a Granada, para ser enterrada en la Capilla Real.1 Dirigió la comitiva Francisco de Borja como caballerizo de la Emperatriz. A la llegada a Granada, donde se debía depositar el cadáver, al serle pedido a los monteros de Espinosa abrir el ataúd en que la llevaban sin separarse nunca ni aún al sueño, y para dar fe del hecho al entregarlo a los monjes que debían sepultarla, y al verla tan alterada en descomposición avanzada por los días de marcha y el calor de la primavera, fue pedido a Francisco allí presente su testimonio también. En ese momento, al contemplar el descompuesto cuerpo de Isabel, Borja, entre lágrimas, pronunció la célebre frase No puedo jurar que esta sea la emperatriz, pero sí juro que es su cadáver el que aquí ponemos … juro también no más servir a señor que se me pueda morir. Tras esto, decidió optar por la vida religiosa y al enviudar de Leonor de Castro, dama portuguesa de la emperatriz, ingresó en la Compañía de Jesús, donde alcanzó la santidad.

* Felipe (21 de mayo de 1527 – 13 de septiembre de 1598), sucesor de su padre en el trono de España (juntamente con sus posesiones en América, los Países Bajos, Milán, Cerdeña, Nápoles y Sicilia) con el nombre de Felipe II;
* María (21 de junio de 1528 – 26 de febrero de 1603), quien en 1548 se casó con el emperador Maximiliano II de Habsburgo, su primo hermano;
* Fernando (22 de noviembre 1529 – muere a los pocos meses)
29 de junio de 1534 (primer aborto varón de la emperatriz)
* Juana (24 de junio de 1535 – 7 de septiembre de 1573), quien en 1552 se casó con su primo hermano Juan Manuel de Portugal, infante heredero de Portugal;
* Juan (19 de octubre de 1537, muere a los pocos días)
1 de mayo de 1539 (segundo aborto varón y muerte de la emperatriz)