María de Habsburgo nació en Madrid el 21 de junio de 1528, falleciendo en el Convento de las Descalzas Reales, Madrid, el 26 de febrero de 1603. Infanta de España y Archiduquesa de Austria, así como Emperatriz del Sacro Imperio y Reina consorte de Hungría y de Bohemia (1563-1572). Fue la hija mayor del emperador Carlos I (V de Alemania) y su esposa Isabel de Portugal, hija del rey Manuel I de Portugal.

Creció y fue criada entre Toledo y Valladolid, principalmente, junto a sus otros hermanos, que, pese a las continuas ausencias de su padre y su orfandad materna, tuvieron así una fuerte base familiar con buen entendimiento y similares puntos de visión para gobernar sus dominios, que ella y su hermano Felipe mantendrían durante toda la vida, a pesar de las distancias y tiempo.

El 15 de septiembre de 1548, se casó en Valladolid con el archiduque Maximiliano, su primo carnal y futuro emperador, que por entonces ya se titulaba rey de Bohemia aunque no sería coronado hasta 1562. Los nuevos esposos fueron regentes de los reinos de España desde ese mismo año hasta 1551, por la ausencia del emperador y del príncipe Felipe.

Después de que Felipe II volviese a asumir la regencia, los archiduques marcharon en 1552 a Viena, dónde estaba la corte de su suegro y tío Fernando. Por aquel entonces no había embajadores españoles en el Imperio, sino que las relaciones diplomáticas se canalizaban a través de los lazos familiares entre ambas ramas de los Habsburgo. María jugaría un importante papel desde entonces hasta su vuelta a España en 1582 como representante de los intereses de España en el Imperio, incluso tras establecerse por fin embajadores oficiales a partir de 1558, seis años después de llegar María a Viena. Los medios de la embajada, que nunca llegó a contar con más de diez oficiales, no eran comparables a los de María, que tenía a su disposición un servicio de alrededor de cien personas.1​ Felipe II utilizó deliberadamente el servicio de su hermana como plataforma de espionaje y grupo de opinión en el Imperio. Maximiliano era consciente de esto y en varias ocasiones intentó reformar el servicio de su esposa.

Poco a poco, Maximiliano va adquiriendo los títulos de su padre siendo nombrado rey de Bohemia y rey de los Romanos desde 1562, rey de Hungría desde 1563 y, finalmente, emperador del Sacro Imperio Romano Germánico desde la muerte de su padre en 1564 hasta su propia muerte en 1576. María era una católica devota, teniendo problemas conyugales por la ambigüedad de su esposo. Tuvo gran influencia sobre sus hijos, entre ellos los emperadores Rodolfo II y Matías.

Después de la muerte de su esposo en 1576 regresó en 1582 a España alegrándose de vivir en «un país sin herejes». Se retiró con su hija Margarita al Convento de las Descalzas Reales de Madrid, que había sido fundado en 1559 por su hermana menor, Juana de Austria, al quedar precozmente viuda, y donde ésta también vivió hasta su muerte en 1573. Felipe II envió a Tomás Luis de Victoria al convento como capellán de su hermana en 1587 permaneciendo a su servicio hasta la muerte de la emperatriz. Una de sus obras más famosas es un Réquiem compuesto para el funeral de María de Austria llamado Officium Defunctorum.

Durante sus pocos años durante el reinado de su nieto, el rey Felipe III, representó cierta influencia en la corte defendiendo, junto a su sobrina, Margarita de Austria-Estiria, una facción Católica y pro-austriaca. Tal debió de ser el poder sobre el rey, que fue uno de los atenuantes para que el duque de Lerma, valido del rey y rival de la emperatriz, trasladase la corte a Valladolid, en 1601 por un breve lapsus de tiempo.

Matrimonio e hijos
El 13 de septiembre de 1548 se casó con su primo el emperador Maximiliano II de Austria. Fue madre de:

* Ana de Austria (1549–1580), reina consorte de España, esposa Felipe II y madre de Felipe III de España.
* Fernando de Austria (1551–1552).
* Rodolfo II de Habsburgo (1552–1612), Emperador del Sacro Imperio Romano Germánico.
* Ernesto de Austria (1553–1595).
* Elisabeth de Austria (1554–1592), Reina consorte de Francia, esposa de Carlos IX.
* María de Austria (1555–1556).
* Matías de Habsburgo (1557–1619), Emperador del Sacro Imperio Romano Germánico.
* Archiduque Maximiliano III de Austria (1558–1618).
* Archiduque Alberto de Austria (1559–1621).
* Wenceslao de Austria (1561–1578).
* Federico de Austria (1562–1563).
* María de Austria (1564).
* Carlos de Austria (1565–1566).
* Archiduquesa Margarita de Austria (1567–1633). Profesó en las Descalzas Reales.
* Archiduquesa Leonor de Austria (1568–1580).